سال پیش استفاده از Agrobacterium tumefaciens به عنوان ناقلی برای خلق گیاهان تراریخته یک رویا بود. امروزه به راحتی با این باکتری انتقال ژن به بسیاری از گونه­های مهم زراعی و باغی انجام می­شود و تعداد گونه­هایی که مستعد انتقال ژن با آگروباکتریوم هستند، روز به روز افزایش می­یابد.
در تعدادی از کشورهای پیشرفته، سطح وسیعی از مزارع گیاهان مهم اقتصادی مثل ذرت، سویا، کلزا، پنبه، سیب­زمینی و گوجه فرنگی به گیاهان تراریخته اختصاص یافته است و روند رو به رشدی در تولید این گیاهان تراریخته با استفاده از آگروباکتریوم، در مقایسه با بمباران ذره­ای دیده می­شود. اما هنوز چالش­های متعدد مستقل از ژنوتیپ در انتقال ژن به بسیاری از گونه­های مهم زارعی و همچنین گونه­های جنگلی مورد استفاده در صنایع چوب و کاغذ وجود دارد. به علاوه، ابراز پایدار و قابل پیش­بینی ژن­های تراریخته کماکان غامض و پیچیده می­باشد. تاکنون در چندین مقاله مروری عالی، جنبه­های مختلف زیست­شناختی آگروباکتریوم، با جزییات شرح داده­ شده است.
در این مقاله، نویسنده توضیح می­دهد که چگونه دانشمندان با استفاده از دانش پایه زیست­شناسی آگروباکتریوم، این باکتری را به عنوان ابزاری در مهندسی ژنتیک گیاهی توسعه می­دهند. نویسنده همچنین در جستجوی این موضوع است که چگونه درک رو به گسترش ما از زیست­شناسی آگروباکتریوم به ما در توسعه کاربرد انتقال ژن به واسطه این باکتری کمک می­کند. وی عقیده دارد که بهبود فناوری انتقال ژن نیاز مبرمی به دست­ورزی این فرآیندهای بنیادی زیست­شناختی خواهد داشت.
طبقه‌بندی جنس آگروباکتریوم و طیف میزبانی
جنس آگروباکتریوم به تعدادی گونه تقسیم می­شود. این تقسیم­بندی عمدتاً بر اساس علائم حاصل از بیماری و طیف میزبان می­باشد. بنابراین، A. radiobacter یک گونه غیر بیماری­زا است، A. tumefaciens عامل بیماری گال تاجی، A. rhizogenes عامل بیماری ریشه مویی و A. rubi عامل بیماری گال نیشکر می­باشد. به تازگی یک گونه جدید به نام A. vitis که عامل ایجاد گال در انگور و تعداد دیگری گیاه است، نیز پیشنهاد شده است. گرچه Bergey's Manual of Systematic Bacteriology هنوز این نام­گذاری را منعکس می­نماید ولی این طبقه­بندی پیچیده و گیج­کننده است. ما می­دانیم که در اکثر موارد، علائم بیماری یاد شده حاصل از نوع پلاسمید مولد تومور است که در درون سویه خاصی وجود دارد. از دست دادن پلاسمید مولد تومور یا جایگزینی آن با پلاسمید دیگر، می­تواند باعث تغییر علائم بیماری شود. به عنوان مثال، آلودگی گیاهان با A. tumefaciens C58 که دارای پلاسمید pTiC58 از دسته پلاسمیدهای نوپالین می­باشد، باعث ایجاد گال تاجی جنینی می­شود. اگر این پلاسمید حذف شود، این سویه باکتری غیر بیماری­زا می­شود. وارد کردن پلاسمید Ri به این سویه که پلاسمید خود را از دست داده است، باعث تبدیل باکتری به سویه A. rhizogenes می شود. به علاوه، با وارد کردن پلاسمید Ti (القا کننده تومور) از A. tumefaciens  به A. rhizogenes، سویه ایجاد شده تومورهایی با ظاهری تغییریافته در گیاه Kalanchoe ایجاد می­کند. بنابراین، چون A. tumefaciens  می­تواند به راحتی با جانشینی یک نوع پلاسمید سرطان­زا با پلاسمید دیگر، به A. rhizogenes تبدیل شود، واژه گونه معنی خود را از دست می­دهد. شاید یک سیستم طبقه­بندی با معنی­تر، جنس آگروباکتریوم را بر اساس خصوصیات متبولیکی و رشد به biovar هایی تقسیم نماید. با استفاده از این سیستم، اکثر سویه­های A. tumefaciens  و  A. rubiبه biovar اول تعلق داشته، سویه­های A. rhizogenes biovar دوم را تشکیل داده و biovar سوم نماینده سویه­های A. vitis می­باشد. سیستم دیگری نیز برای طبقه­بندی جنس آگروباکتریوم پیشنهاد شده است. تکمیل توالی­یابی DNA کل ژنوم A. tumefaciens C58 که مرکب از یک کروموزوم خطی، یک کروموزوم حلقوی، یک پلاسمید Ti و یک پلاسمید بزرگ دیگر می­باشد، ممکن است نقطه شروعی برای طبقه­بندی مجدد سویه­های Agrobacterium در گونه­های واقعی گردد. علی­رغم سرگردانی موجود در طبقه­بندی گونه­ها، شاید مهمترین موضوع در مهندسی ژنتیک گیاهان، طیف میزبانی سویه­های مختلف آگروباکتریوم ­باشد. به عنوان یک جنس، آگروباکتریوم می­تواند DNA را به تعداد قابل ملاحظه­ای از موجودات زنده شامل بسیاری از دولپه­ای­ها و تک­لپه­ای­ها در گونه­های نهان­دانه و بازدانگان منتقل نماید. به علاوه، آگروباکتریوم توانایی انتقال ژن به قارچ­هایی مثل مخمر، آسکومیست­ها و بازیدومیست­ها را دارد. در سال 2001 انتقال DNA به سلول انسانی توسط آگروباکتریوم گزارش شده است. اساس مولکولی و ژنتیکی طیف میزبان یک سویه آگروباکتریوم هنوز روشن نشده است. مطالعات اولیه حاکی از این است که پلاسمید Ti در مقایسه با ژن­های کرورموزومی، تعیین­کننده ژنتیکی اصلی طیف میزبانی می­باشد. نشان داده شده است که چندین مکان ژنی بیماری­زایی (vir) بر روی پلاسمید Ti ازجمله virC و virF، در تعیین گونه­های گیاهی که انتقال ژن به آنها می­تواند صورت گیرد تا تومورهای گال تاجی ایجاد شود، نقش دارند. مشخص شده که مکان ژنی virH که قبلاً pinF نامیده می­شد، در توانایی آگروباکتریوم در انتقال ژن به ذرت موثر می­باشند. سایر ژن­های vir مثل virG نیز در بیماری­زایی بیش از حد برخی سویه­های خاص مشارکت دارند.
به هرحال اکنون روشن شده است که طیف میزبانی فرآیند بسیار پیچیده­ای می­باشد که تحت کنترل ژنتیکی چندی عامل در باکتری و میزبان گیاهی می­باشد. نتیجه هر تلاش و تحقیقی برای انتقال ژن به گیاهان مختلف، خصوصاً گیاهان جدید، اطلاعاتی درباره طیف میزبانی آگروباکتریوم به ما می­دهد. به طور مثال، امروزه انتقال ژن به بسیاری از گونه­های گیاهان تک­لپه مثل ذرت، برنج، جو و گندم توسط بسیاری از سویه­های  آگروباکتریوم ممکن شده و و فنوتیپ مقاومت به علف­کش و آنتی­بیوتیک در آنها ایجاد شده است اما تومور گال تاجی در این گونه­های گیاهی رشد نمی­کند. شاید طیف میزبانی حاصل برهمکنش پلاسمید Ti خاصی با زمینه کروموزومی باکتریایی مشخصی باشد. به طور مثال، پلاسمید pTiBo542 در سویه طبیعی خود یعنی A. tumefaciens Bo542 قابلیت تومورزایی محدودی بر روی گونه­های متعدد بقولات دارد. این پلاسمید اگر در زمینه کروموزومی A. tumefaciens C58 قرار گیرد، باعث بیماری­زایی قوی در سویا و سایر بقولات می­شود. سرانجام، حساسیت به بیماری گال تاجی، یک اساس ژنتیکی در کدوییان، نخود، سویا، انگور و حتی اکوتیپ­های مختلف Arabidopsis thaliana دارد. نقش ژن­های بیماری­زایی باکتری و ژن­های میزبان در فرآیند انتقال ژن و راه­های دست­ورزی آنها برای مقاصد مهندسی ژنتیک، در ادامه شرح داده خواهد شد.
T-DNAچیست؟
اساس مولکولی انتقال ژنتیکی به گیاهان توسط آگروباکتریوم انتقال یک منطقه از یک پلاسمید بزرگ القا کننده تومور (Ti) یا ریشه­زا (Ri) از آگروباکتریوم و ادغام آن در ژنوم گیاه می­باشد
A)    T-DNA به سه ناحیه T-DNA چپ (TL)، T-DNA مرکزی (TC) و T-DNA (TR ) راست تقسیم می­شود. دایره­های توپر سیاه نشانه توالی­های تکراری حاشیه T-DNA هستند. oriV نقطه شروع همانندسازی پلاسمید Ti با دایره توخال نمایش داده شده است.
B)    رونوشت­های متنوع رمزشده توسط T-DNA در پلاسمید Ti و جهت رونویسی آنها با بردارها نمایش داده شده است. ژن­ها رمزکننده فعالیت­هایی شامل ساخت اکسین (auxin)، ساخت سایتوکینین (cyt)، مانوپین (mas) و آگروپین (aga)  نشان داده شده­اند.
اندازه پلاسمید Ti 200 تا 800 کیلو باز است. T-DNA یا DNA منتقل شونده در منطقه T  بر روی پلاسمید Ti یا Ri قرار دارد. اندازه منطقه T در پلاسمیدهای طبیعی Ti و Ri حدوداً 10 تا 30 کیلو باز است. بنابراین، منطقه T عموماً 10 درصد پلاسمید Ti را شامل می­شود. برخی پلاسمیدهای Ti یک منطقه T داشته و برخی دارای چند منطقه T می­باشند. فرآیند انتقال T-DNA از پلاسمید Ti و ارسال آن از باکتری به سلول گیاهی حاصل فعالیت ژن­های بیماری­زا (vir) می­باشد که توسط پلاسمید Ti حمل می­شوند.
منطقه T با توالی­های حاشیه­ای T-DNA معین می­شود. این حاشیه­ها 25 جفت باز طول دارند و از نظر توالی بسیار همسان هستند. آنها منطقه T را با تکرارهای هم جهت از دو طرف در بر گرفته­اند. به طور کلی، کناره­های T-DNA حدود آن را تعیین می­کنند (البته موارد استثنایی نیز وجود دارد که به آنها اشاره خواهد شد)، چون این توالی­ها هدف اندونوکلئازهای اختصاصی کناره­ها یعنی VirD1/VirD2 که T-DNA را Ti plasmid جدا می­کنند، می­باشند. به نظر می­رسد که یک قطبیت در کناره­های T-DNA وجود دارد به طوری که در ابتدا به نظر می­رسد کناره راست بسیار مهم­تر از کناره چپ است. عوامل متعددی باعث ایجاد این قطبیت می­شوند. اول اینکه توالی­های حاشیه­ای فقط به عنوان هدف اندونوکلئاز VirD1/VirD2 عمل نمی­کنند بلکه به عنوان یک محل اتصال کووالانت به پروتئین VirD2 نیز عمل می­کنند. در پلاسمید Ti و Ri (یا در ناقل­های دوتایی T-DNA) کناره­های T-DNA باعث به هم وصل شدن DNA دورشته­ای می‌شود. شکستن این توالی­های کناره­­ای دورشته­ای شده هم در شرایط in vivo  و هم in vitro، نیازمند پروتئی­های VirD1 و VirD2 می­باشد، هرچند در شرایط in vitro پروتئین VirD2 به تنهایی می­تواند یک توالی تک رشته­ای حاشیه­ای T-DNA را ببرد. شکتن توالی حاشیه­ای 25 جفت بازی T-DNA عمدتاً با ایجاد شکافی در "رشته پایینی" T-DNA به طور قراردادی، بین نوکلئوتید 3 و 4 صورت می­گیرد. شکستن دورشته­ای نیز در کناره­های T-DNA گزارش شده است. ایجاد شکاف در توالی حاشیه­ای با پیوستگی محکم (شاید کووالانت) پروتئین VirD2 از طریق تیروزین موقعیت 29 با انتهای 5' مولکول تک­رشته­ای حاصل از T-DNA که رشته T خوانده می­شود، همراه است. این رشته T است که به جای مولکول دورشته­ای T-DNA، به سلول گیاهی منتقل می­شود. در این حالت، این پروتئین VirD2 است که به حاشیه راست متصل شده (مستقیماً به خود توالی حاشیه متصل نمی­شود) و باعث ایجاد قطبیت و اهمیت حاشیه راست نسبت به حاشیه چپ می­شود. ذکر این نکته لازم است که چون شکاف در حاشیه چپ نیز برای اتصال VirD2 به بقیه مولکول لازم است (قسمت غیر T-DNA پلاسمید Ti یا ناقل دوتایی T-DNA) این موضوع ممکن است باعث فرآیند جداسازی رشته T از پلاسمید Ti یا پلاسمید Ri و ناقلین دوتایی T-DNA باشد. مشکل انتقال "بقیه قسمت­های"4 ناقل به گیاه در ادامه شرح داده خواهد شد.
دوم اینکه شاید حضور توالی­های overdrive T-DNA نزدیک به حاشیه راست بسیاری از T-DNAها، نیز به ایجاد قطبیت بین حاشیه چپ و راست کمک نماید. توالی­های overdrive باعث تقویت انتقال رشته T به گیاهان می­شوند، گرچه هنوز سازکار مولکولی این موضوع ناشناخته است. گزارش­های اولیه حاکی از این است که پروتئین VirC1 به توالی overdrive متصل می­شود و شاید بریده شدنحاشیه T-DNA توسط اندونوکلئاز VirD1/VirD2 را تقویت کنند. عمل VirC1 و virC2 برای بیماری­زایی بسیار مهم است و جهش این دو ژن باعث عدم بیماری­زایی در بسیاری از گونه­های گیاهی می­شود. اما گزارش­هایی ارائه شده که تولید T-DNA در جهش­یافته­های ژن virC آگروباکتریوم را در سطح گونه وحشی دانسته­اند. بنابراین هر گونه اثر virC پس از پردازش T-DNA رخ می‌دهد
همان طور که در مطالب پیشین ذکر شد، بسیاری از پروتئین‌هایی که توسط ژن‌های vir رمز می‌شوند، نقشی ضروری در فرآیند انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم دارند. برخی از این نقش‌ها در چندین مقاله مروری برجسته شرح داده شده است، بنابراین در مقاله حاضر، نقش‌های پروتئین‌های Vir که می‌توانند با هدف بهبود فرآیند انتقال ژن مورد دست‌ورزی قرار گیرند، به طور محدودتری توضیح داده شده است. پروتئین‌های VirA و VirG به عنوان عضوی از یک سیستم تنظیمی ژنتیکی دو بخشی حسی‌ترارسانی پیام عمل می‌کنند. VirA یک شاخک پری‌پلاسمیک است که حضور ترکیبات فنلی گیاهی خاصی را در زمان زخم القا می‌شود، حس می‌کند. VirA با هماهنگی با یک مولکول حامل مونوساکاریدی به نام ChvE و در حضور مقدار مناسبی فنل و مولکول قند، خود و پروتئین VirG را فسفریله می‌کند. VirG در حالت غیر فسفریله غیرفعال است، اما در حالت فسفریله، این پروتئین به فعال شدن یا افزایش سطح رونویسی ژن‌های vir کمک می‌کند. این کار احتمالاً از طریق برهمکنش با توالی جعبه-vir که بخشی از راه‌انداز ژن‌های vir است، صورت می‌گیرد. پروتئین‌های همیشه فعال VirA و VirG که نیازی به القا‌کننده فنلی برای فعالیت خود نداشته یا پروتئین‌های VirG که برهمکنش بهتری با توالی جعبه-vir برای فعال کردن ابراز ژن‌های vir داشته باشند، شاید برای بهبود کارآیی انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم و طیف میزبانی مفید باشد.
VirD4 به همراه 11 پروتئین VirB، یک سیستم ترشحی نوع 4 که برای انتفال T-DNA و چند پروتئین­ دیگر Virشامل VirE2 و VirF لازم است، می­سازند. شـایـد VirD4 بـه عنــوان یـک پیونـددهنـده عمـل نمـایـد تـا برهمکنــش مـجـمـوعـه T-DNA/VirD2 با سیستم ترشحی رمزشده VirB را افزایش دهد. بیشتر پروتئین­های VirB یا کانال غشایی می­سازند یا به عنوان ATPase، انرژی لازم برای تشکیل کانال یا فرآیندهای خروج مولکول­ها را فراهم می­کنند. چندین پروتئین شامل VirB2، VirB5 و احتمالاً VirB7 در ساختن T-pilus شرکت دارند. VirB2 اصلی­ترین پروتئین پیلین است. عمل پیلوس در انتقال T-DNA هنوز روشن نیست، ولی شاید به عنوان کانالی برای عبور T-DNA و پروتئین­های Vir عمل نماید یا شاید فقط به عنوان قلابی برای برقراری ارتباط با سلول گیاهی پذیرنده عمل نمایند و باکتری و گیاه در نزدیکی هم قرار داده تا انتقال مولکولی موثری صورت گیرد. جنبه مهم زیست­شناسی پیلوس که شاید در انتقال ژن اهمیت داشته باشد، ناپایداری آن در حرارت است. گرچه حداکثر القا ژن­های vir در دمای 25 تا 27 درجه است، پیلوس برخی از سویه­های آگروباکتریوم در دماهای پایین­تر (18 تا 20 درجه)، پایدارتر است. آزمایش­های اولیه حاکی از اثر درجه حرارت بر انتقال ژن است. بدین ترتیب، برخی شاید کشت همزمان آگروباکتریوم و سلول­های گیاهی را در دمای پایین و طی چند روز آغازین فرآیند انتقال ژن مورد بررسی قرار دهند.
پروتئین­های VirD2 و VirE2نقشی حیاتی و احتمالاً کامل­کننده در انتقال ژن به واسطه آگروباکتریوم بازی می­کنند. گفته می­شود که این دو پروتئین به همراه رشته T، مجموعه­ای به نام مجموعه T تشکیل می­دهند که شکل انتقال شونده T-DNA می­باشد. اینکه این مجموعه داخل باکتری سوار می­شود یا نه هنوز مورد مباحثه است. Citovsky و همکارانش نشان داده­اند که VirE2 می­تواند داخل سلول گیاهی کار خود را انجام دهد: گیاهان تراریخته توتون که توانایی ابراز VirE2  را کسب کرده بودند، با سویه­های جهش­یافته virE2 آگروباکتریوم آلوده می­شدند. چندین آزمایشگاه نیز نشان داده­اند که VirE2 می­تواند در غیاب رشته T به سلول گیاهی منتقل شود و ممکن است که مجموعه VirE2 و رشته T، یا در کانال انتقال باکتری یا داخل سلول گیاهی تشکیل شوند. نتایج تحقیقات جدید حاکی از آن است که شاید VirE2 نقش دیگری نیز در مراحل اولیه فرآیند انتقال ژن دارد: Dumas و همکارانش نشان داده­اند که VirE2 در شرایط in vitro می­تواند با مشارکت غشا مصنوعی، کانالی برای انتقال مولکول­های DNA خلق نمایند. بنابراین، ممکن است که یک وظیفه VirE2، تشکیل سوراخی در غشا سیتوپلاسمی برای تسهیل عبور رشته T باشد. به دلیل اتصال VirD2 به انتهای 5' رشته T، این پروتئین ممکن است به عنوان راهنمای این رشته برای عبور از کانال انتقالی نوع 4 عمل نماید. VirD2 همچنین ممکن است در مراحل دیگری از فرآیند انتقال ژن، در داخل سلول گیاهی، نقش داشته باشد. VirD2 دارای توالی "پیام مکان­یابی هسته­ای" (NLS) بوده که ممکن است در هدایت این پروتئین و T-DNA متصل به آن به سوی هسته سلول گیاهی، کمک نماید. توالی NLS در پروتئین VirD2 می­تواند مجموعه­های T ساخته­شده در آزمایشگاه که شامل پروتئین‌های گزارشگر نیز می­باشند، به هسته سلول­های گیاه، جانور و مخمر هدایت کند.