بازیافت DNA
با اهداف متفاوت ژنتیکی صورت می گیرد که یکی از این اهداف توالی یابی DNA می باشد. لذا ضرورت دارد که مراحل بازیافت DNA برای هرگونه گیاهی بهینه شود.در مقاله پیش رو به معرفی این عمل در مورد گندم خواهیم پرداخت.
به منظور بهینه سازی شرایط باز یافت DNA از ارقام مختلف گندم ، تحقیقی در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی دانشگاه زابل صورت گرفت .DNA این ارقام به روش دلاپورتا استخراج ، پس از تعیین غلظت نمونه ها برای تکثیر قطعات DNA الگو از پرایمرهای تصادفی و نیمه تصادفی استفاده شد . پس از الکتروفورز محصولات حاصل از PCR برروی ژل آگارز ۱% ، باندهای تکثیری که از کیفیت و وضوح خوبی برخوردار بودند انتخاب و از روی ژل جدا شده و روشهای مختلف برای بازیافت DNA استفاده شد که مناسبترین روش بازیافت ، استفاده از PCR مجدد و ته نشین کردن DNA حاصله با اتانول بود . که در این روش باند جدا شده از ژل پس از سانتریفیوژ لحظه ای ،به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰- قرار داده شد و سپس در دمای ۶۵ درجه حمام آب گرم قرار داده شد تا باند ذوب شود پس از آن باند ذوب شده را در تریس حل کرده و از این محلول به عنوان ماده اصلی مجدداً برای PCR استفاده گردید . PCR با همان شرایط PCR اولیه صورت گرفت و محصولات PCR الکتروفورز گردیده و در صورت تشکیل باند،باند حاصله را با اتانول ته نشین کرده که این DNA ته نشین شده آماده توالی یابی میگردد .
مقدمه:
گندم مهمترین غله ایران ودنیا است. مبدأ اصلی گندم به عنوان مهمترین غله ایران وجهان در جنوب غربی آسیا بوده و۱۰تا ۱۵ هزار سال قبل از میلاد مسیح از این گیاه در تغذیه انسانها استفاده می شده است.دامنه وسیع وسازگاری زیاد این گیاه وهمچنین مصارف متنوع این غله در تغذیه انسانها باعث گردیده که بعنوان مهمترین غله جهان بویژه در کشورهای در حال توسعه وجهان سوم مطرح گرددو حدود ۲۰درصد منابع غذایی مردم جهان را تشکیل دهد. در ایران سرانه مصرف گندم برای هر فرد ۱۵۰ تا۲۰۰ کیلو گرم می باشد.با توجه به روند رو به افزایش جمعیت ، در کشورهای در حال توسعه وایران واهمیت اقتصادی وسیاسی تولید این گیاه باید نگاهی ویژه، به تولید واصلاح آن داشت. از طرف دیگر محدودیت ارقام سازگار به خشکی، شوری،سرماومقاوم به بیماریها وآفات وسازگار با شرایط موجود در مناطق مختلف یکی دیگر از عواملی است که تولید این غله را در کشورهای در حال توسعه وایران با بحران روبرو نموده است.ورود مداوم ا رقام اصلاحی از خارج از کشورنیز به علت ایجاد وابستگی کشور به دیگر کشورها مقرون به صرفه نمی باشد. لذانیاز به اصلاح این گیاه وبهره گیری از ارقام محلی ،بومی وخویشاوندان وحشی آنها با توجه به تنوع ژنتیکی بالا ودارا بودن صفاتی چون مقاومت به بیماریها ،آفات ،خشکی ،سرما وشوری بر هیچکس پوشیده نیست.
توالی یابی DNA یکی از کاربردهای واکنش زنجیره ای پلیمراز می باشد که بدین منظور بایستی محصولات حاصل از PCR را از ژل آگارز بازیافت نمود .
برای هر گونه روش توالی یابی ، در اختیار داشتن مقدار نسبتاً زیادی از قطعه های یکسان DNA تک رشته ای ضروری است
خلوص بالای نمونه های DNA برای توالی یابی ضروری است ، تا نتایج حاصل از توالی یابی از کیفیت خوبی برخوردار باشد ، روشهای مختلف مورد استفاده برای خالص سازی DNA بایستی بتواند از محصولات PCR ، نمونه های DNA خالص با غلظت مناسب بدست آورد.
برای توالی یابی قطعات DNA مربوط به فراورده های PCR روشهای متعددی وجود دارند که امکان تعیین سریع توالی مورد نظر را فراهم می آورند.
توالی یابی مستقیم فراورده های PCRاین امکان را فراهم می آوردتا ویژگیهای توالیهای مورد نظر بدون نیاز به کلون کردن فرعی یا زیر کلونسازی سریعأ تعیین شوند.مزیت دیگر آن در اینست که اشتباهات ناشی از که در فراوده های تکثیری مشاهده می گردند،تشخیص داده نمی شوند.چرا که این اشتباهات باید به ندرت در موقعیتهای تصادفی در قطعه تکثیری بوقوع بپیوندند.
توالی یابی توده بزرگی از مولکولهای موجود در DNAتکثیر یافته امکان تشخیص اشتباهات PCRرا ازبین می برد،مگر اینکه PCRبر روی مقادیر بسیار کمی از DNAالگو انجام شود،در اینصورت این امکان وجود دارد که اشتباهی در اوایل تکثیر PCR رخ دهد و در نهایت بتوان آن را در فراورده های نهایی PCR تشخیص داد. بنابراین پس از توالی یابی مستقیم ،یک توالی عمومی ازمولکولهای DNA در مخلوط واکنش PCR حاصل می گردد.
مواد وروشها:
این تحقیق درسال ۱۳۸۴ در آزمایشگاه ژنتیک مولکولی وابسته به مرکز زیست پژوهشی علوم سلولی ومولکولی (بیوسنتر) دانشگاه زابل صورت گرفت.
مواد گیاهی :
تعداد ۱۲ رقم ولاین گندم از کلکسیون بذر ومرکز تحقیقات زابل تهیه شد که این ارقام شامل:
Pethneer-2123/Hirmand,V.8187/Arvand-7,Pethneer-2123/Bolani,Hirmand ,Kalak Afghan,Star,Kavir ,Vees/3/Bows/Vees/Kaf/4/Bolani,Alvand,Mahdavi ,Bolani,Hamoon.
بذور در داخل گلدانهایی کشت واز برگهای سبز برای استخراج DNA استفاده گردید.
استخراج DNA:
استخراج DNAازنمونه های گیاهی با روش دلاپورتا وهمکاران(Dellaporta et al 1993) انجام شد.
برای تعیین کمیت وکیفیت DNA ازدو روش الکتروفورز برروی ژل آگارز وبیوفتومتر استفاده شد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز:
در این تحقیق برای تکثیر قطعات DNA الگو از پرایمرهای تصادفی ونیمه تصادفی استفاده شد، واکنش زنجیره ای پلیمراز با حجم ۲۵ میکرولیتر حاوی بافر PCR ،کلرور منیزیم ، پرایمر ، dntp ،آنزیم Taq و ۳۰ نانوگرم از DNA ژنومی از هر نمونه انجام گردید .
برای واکنش زنجیره ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر از دو نوع برنامه حرارتی استفاده گردید .
مرحله اول واسرشت سازی ،به مدت ۵۰ ثانیه در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد .
مرحله دوم اتصال ،برای پرایمر های تصادفی به مدت ۵۰ ثانیه در دمای ۳۴ درجه سانتیگراد
و برای پرایمرهای نیمه تصادفی به مدت ۵۰ ثانیه در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد .
مرحله سوم بسط ، به مدت ۹۰ ثانیه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد که این سه مرحله ۴۰ سیکل تکرار گردید و درنهایت یک سیکل تکمیل کننده بسط به مدت ۸ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد انجام شد .
جدا سازی قطعات تکثیری:
برای جدا سازی قطعات تکثیرشده از ژل آگارز ۵/۱ درصد ورنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید استفاده شد.
بازیافت DNA:
پس از مشاهده باندهای تکثیر شده ،باند هایی که از وضوح و کیفیت خوبی برخوردار بودند انتخاب وازروی ژل جدا شد،سپس باند جدا شده را در تیوپ قرار داده وسانتریفیوژ لحظه ای انجام شد.سپس به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰- قرارداده شد وبعد از عمل منجمد شدن ،در حمام ۶۵درجه قرار گرفت تا باند ذوب گردد.پس از آن باند ذوب شده را در تریس ۱۰میلی مولار حل کرده واز این محلول به عنوان ماده اصلی مجددأ برای PCR استفاده گردید.
قبل از انجام PCR مجدد، DNA بازیافت شده با دستگاه بیوفتومتر تعیین غلظت گردید وسپس با همان غلظتی که برای PCR اولیه انجام شده بود برای PCR دوم نیز در نظر گرفته شدو PCRمجدد صورت گرفت.پس از آن محصول PCRبر روی ژل آگارز ۵/۱ درصد الکتروفورز شد وبعد از رنگ آمیزی توسط اتیدیوم بروماید ومشاهده باندها عمل ته نشین نمودن DNAانجام گرفت .
ته نشین کردن DNA :
ابتدا حجم محصول PCRرا اندازه گرفته وسپس ۱/۰ حجم آن استات سدیم ۳مولار(PH=5.2)ویک حجم ایزوپروپانول اضافه گردید.سپس به مدت ۱۰دقیقه در۱۴۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید.پلیت حاصله با اتانول ۷۰%چندین بار شسته شدوبعد از خشک شدن پلیت در تریس ۱۰میلی مولارحل گردید.
این آخرین مرحله بازیافت می باشدوبعد از آن DNAآماده توالی یابی می باشد.
نتایج وبحث:
برای بازیافت DNAاز روشهای مختلفی استفاده شد که این روشها عبارتند از:
۱-بازیافت نمونه های DNA با فنول
در این روش بعد از جدا کردن باند مورد نظر وذوب کردن باند ،یک حجم به آن فنول اشباع شده با TEاضافه ونمونه ها به مدت ۳۰ثانیه ورتکس گردید سپس به مدت ۵دقیقه در ۱۳۰۰۰دور سانتریفیوژ شدند تا فازها از هم جدا شوند سپس فاز بالایی به تیوپ جدید منتقل و به نسبت ۱:۱ فنول اشباع شده با TEوکلروفرم اضافه ومجددأ سانتریفیوژ گردید وسپس فاز بالایی به تیوپ جدید منتقل و یک حجم اتر به آن اضافه وورتکس لحظه ای انجام شد وسپس برای ۳دقیقه در۱۳۰۰۰دور سانتریفیوژ شد.فاز بالایی به تیوپ جدید منتقل گردید ودوباره یک حجم اتر اضافه گردید وعمل سانتریفیوژ تکرار شد.سپس برای ته نشین کردن DNAاز اتانول استفاده شد.۵/۲ حجم اتانول ۹۵% و۱/۰ حجم استات سدیم ۱۲/۰ مولار به تیوپ اضافه واینورت گردید .سپس در حمام آب یخ به مدت ۱۰دقیقه قرار گرفت وبعد ازآن به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴درجه سانتی گراد و۱۲۰۰۰دور سانتریفیوژ شد.فازرویی را جدا کرده وسپس اتانول ۸۰%به ان اضافه ودر دمای اتاق برای ۱۰-۵ دقیقه قرار گرفت وسپس برای ۵ دقیقه در ۱۲۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید. فاز بالا یی دور ریخته شد وپلیت حاصله به مدت ۱۰-۵ دردمای اتاق قرار گرفت تا خشک شود.وبعد از آن در تریس ۱۰میلی مولار حل گردید. که در این روش هیچ گونه پلیتی حاصل نشد.
روش دوم :بازیافت DNAاز ژل آگارز (با نقطه ذوب پایین)روشی که آقای siraisi استفاده کرده اند.در این روش قطعه DNAاز ژل آگارز با نقطه ذوب پایین پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید ومشاهده باند جدا و به تیوپ منتقل شد وسپس دو حجم TEو۳/۰ حجم استات سدیم ۳مولاربا ۷ =PHبه ان اضافه گردید ودر حمام آب گرم ۶۵درجه گذاشته شد تا زمانی که ژل ذوب گرددوبا TEمخلوط گردد.سپس یک حجم فنول اشباع شده باTEبه ان اضافه وبه مدت ۳۰ ثانیه ورتکس گردید.وبعد از آن به مدت ۵ دقیقه در دمای ۴درجه سانتی گراد ودر۱۳۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید.سپس فازرویی به تیوپ جدید منتقل وبعد با اتانول ته نشین گردید.مراحل ته نشین کردن در قسمت قبل توضیح داده شده است.در این روش DNA بدست آمده از کمیت وکیفیت مناسبی برخوردار نبود.
روش سوم که توسط سلوکی وهمکاران انجام شد.در این روش پس از جدا کردن باند مورد نظر ازژل وانتقال به تیوپ به مدت ۲دقیقه در ۸۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید وسپس ۴۰۰میکرولیتر آب مقطربه آن اضافه ودر حمام آب گرم ۶۵درجه سانتی گراد به مدت ۱۰ دقیقه قرار گرفت وسپس ۵۰۰میکرولیتر فنول به آن اضافه و۳۰ثانیه ورتکس گردید.پس از آن به مدت ۱۰ دقیقه در ۸۰۰۰دور سانتریفیوژ شد.فاز رویی را بر داشته وبه تیوپی که حاوی ۲۵۰میکرولیتر فنول و۲۵۰کلروفرم بود منتقل شد.نمونه ها به مدت ۳۰ ثانیه ورتکس وسپس به مدت ۵دقیقه در ۸۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید.فاز رویی به میکرو تیوپ منتقل و۵۰۰میکرولیتر کلروفرم به آن اضافه شد ومانند مرحله قبل ورتکس وسانتریفیوژ گردید.مجددأ فاز رویی به تیوپ جدید منتقل وبرای ته نشین کردن DNA از ۱میکرو لیتر استات آمونیوم (۵/۷ مولار)و۵/۲ حجم اتانول استفاده شد وسپس در ۲۰- درجه سانتی گراد برای ۲۴ساعت قرار گرفت.ودر روز بعد نمونه ها به مدت ۳۰دقیقه در ۸۰۰۰دور سانتریفیوژ گردید. پلیت حاصله پس از خشک شدن درتریس ۱۰میلی مولار حل گردید.در این روش نیز DNAحاصله از کمیت وکیفیت مناسبی برخوردار نبود.
روش چهارم که استفاده از PCRمجدد بود درقسمت ماد وروشها توضیح داده شده است . این روش بهترین ومناسبترین روش برای بازیافت DNAبود زیرا که DNA حاصله
از کیفیت وکمیت مناسبی بر خوردار بودو همین روش به عنوان روش اصلی برای بازیافت انتخاب شد.
منابع:
۱-آذرکیش ،ر؛ ۱۳۸۰٫تجزیه وتحلیل چند متغیره ، جهت بررسی تنوع ژنتیکی واجزای عملکرد در گندم دوروم.پایان نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات . دانشکده کشاورزی ، دانشگاه زابل.
۲- ارزانی ،ا ؛ اصلاح گیاهان زراعی.(ترجمه).انتشارات دانشگاهی صنعتی اصفهان؛ ۱۳۸۰٫
۳- خلف باغی،م؛۱۳۸۳٫تعیین فاصله ژنتیکی ارقام گندم بااستفاده از نشانگر های مولکولی،پایان نامه کارشناسی ارشد اصلاح نباتات .دانشکده کشاورزی، دانشگاه زابل.
۴- رجب زاده، ن؛تکنولوژی نان ؛ انتشارات دانشگاه تهران؛۱۳۶۸٫
۵- شهریاری،ف؛امام جمعه،ع؛واکنش زنجیره ای پلیمراز،مقدمه ای بر تکنیکهای مولکولی ؛۱۳۸۱٫
۶- صبور ، م؛ علمی غروی ،ح ، ۱۳۸۱، واکنش زنجیره ای پلیمراز ، مقدمه ای بر تکنیکهای مولکولی ؛ چاپ اول
۷ – کریمی،ه ؛گندم؛ انتشارات دانشگاهی تهران ، ۱۳۶۸٫
۸- Dellaporta s.l.,wood.j.,and Hicks,j.b.1993.Aplant DNA mini preparation Version II.plant Mol .Biol Rep.1.19